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惡性瘧原蟲對小分子化合物庫(Malaria Box)和雙氫青蒿素的篩選及醫學抗藥性機制研究

發布時間:2019-01-23 21:40 論文編輯:lgg 價格: 所屬欄目:醫學論文 關鍵詞: 惡性瘧原蟲化合物庫雙氫青蒿素

本文是一篇醫學論文,由于病理解剖學和細胞病理學的影響,當時的臨床醫學中特别注意對内髒器官病理變化的研究和診斷,想盡各種方法尋找“病竈”,使診斷方法不斷充實,診斷手段和輔助

本文是一篇醫學論文,由于病理解剖學和細胞病理學的影響,當時的臨床醫學中特别注意對内髒器官病理變化的研究和診斷,想盡各種方法尋找“病竈”,使診斷方法不斷充實,診斷手段和輔助診斷工具不斷增多。(以上内容來自百度百科)今天為大家推薦一篇醫學論文,供大家參考。
 
前 言
 
古老的疾病——瘧疾,伴随着人們曆史進程,早在公元前,古埃及,古羅馬和中國就有對瘧疾病症的描述和記載,随着人類的活動不斷擴大,到 19 世紀初世界各地均有瘧疾病例報道。惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum),間日瘧原蟲(P. vivax),三日瘧原蟲(P. malariae)和卵形瘧原蟲(P. ovalee)是感染人類常見的四種瘧原蟲。2004 年,研究人員在馬來西亞,泰國和菲律賓等地發現諾氏瘧原蟲(P. knowlesi)感染病例,該蟲成為第 5 種感染人的瘧原蟲。目前,瘧疾仍然在 91 個國家和地區發生和流行,大約有 212 百萬人感染,其中惡性瘧原蟲感染了約 95%的病例。約 42.9 萬人因感染瘧疾而死亡,五歲以下兒童占比約 70%,惡性瘧原蟲引起了 99%的死亡病例。在我國,瘧疾仍是一種重要的人獸共患病,分布很廣,各省和地區均有瘧疾病例發生。尤以海南和雲南兩省居多,其中海南島以惡性瘧原蟲感染病例為主;而雲南省間日瘧原蟲和惡性瘧原蟲都很流行。由于缺乏有效的疫苗,藥物治療仍是目前瘧疾主要的防控手段。盡管人們在藥物研發上取得了最大的成果,但是在東南亞,非洲等地,惡性瘧原蟲對青蒿素、奎甯和氯喹等常用藥物的抗藥性興起和擴散,已成為全球防控瘧疾的重大威脅。為了探求惡性瘧原蟲抗藥性的機制,各國的科研人員進行的不懈的努力,發現一些重要的抗性位點,例如 pfmdr1,pfcrt 和 kelch 13 等抗性基因位點的發現。但是惡性瘧原蟲的抗藥性的機理是複雜的,且存在着遺傳性和非遺傳性的機制。不可能通過已發現的幾個基因位點闡明所有的問題。本課題就臨床惡性瘧原蟲株潛在抗性和體外篩選惡性瘧原蟲對雙氫青蒿素抗性兩個方面進行了探索。
首先本研究利用中緬邊境的臨床抗性惡性瘧原蟲蟲株,對新型抗瘧試劑盒(Malaria Box)進行了篩選。基于 Malaria Box 對各個蟲株的抑制效果,我們一方面鑒定 Malaria Box 中抑蟲效果良好的新型化合物,另一方面檢測到潛在的抗藥性存在,研究結果對新型抗瘧藥物的研發和使用具有指導意義。之後全基因組測序所用惡性瘧原蟲株,找尋潛在的抗性基因位點,為惡性瘧原蟲的抗藥機制提供了新的線索。實驗的另一部分是體外篩選惡性瘧原蟲對雙氫青蒿素抗性機制的研究,本研究經過近三年的雙氫青蒿素(DHA)藥物實驗室篩選,獲得了抗性較高的惡性瘧原蟲克隆蟲株。之後在半數緻死量(IC50),藥物生存實驗,環狀體和滋養體生存實驗,紅内期生長周等表型上加以觀察,然後通過全基因組分析,尋找抗 DHA 的抗性機制,盡可能發現新的線索,為以後的研究提供參考。
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第一篇 文獻綜述
 
第 1 章 瘧原蟲研究簡介
古老的疾病瘧疾,伴随了整個人類的曆史的進程[1]。公元前 2700 年,中國及古埃及描述了瘧疾的相關症狀規律性發熱和脾腫大,公元前 200 年左右,瘧疾已經傳播到羅馬,12 世紀蔓延至歐洲全境,19 世紀初期,全世界各個地區均有瘧疾病例的報告。瘧原蟲是瘧疾的病原體,屬于真球蟲目,瘧原蟲科,瘧原蟲屬的單細胞生物。已知有4種瘧原蟲可感染人類,分别是惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum),間日瘧原蟲(Plasmodium vivax),卵形瘧原蟲(Plasmodium ovale)和三日瘧原蟲(Plasmodiummalariae)[2,3]。其中,P.falciparum 是人類瘧疾的主要病原體[4]。目前,瘧疾仍然在 91 個國家和地區發生和流行,大約有 212 百萬人感染,惡性瘧原蟲感染了約 95%的病例。約 42.9 萬人因感染瘧疾而死亡,五歲以下兒童占比約 70%。惡性瘧原蟲引起了 99%的死亡病例[2]。
 
1 惡性瘧原蟲的生活史及入侵細胞研究簡介
瘧原蟲的生活史是一個複雜的過程,它需要經過無脊椎動物按蚊和脊椎動物人類兩個宿主(圖 1.1)。而在人體内又可分為紅外期和紅内期兩個時期。生長周期起始于雌性按蚊叮咬吸血。瘧原蟲的子孢子(sporozoites)被植于宿主皮下,sporozoites 随後穿過皮膚到達血液循環。經過大約 30 分鐘後,sporozoites到達肝細胞,之後入侵肝細胞,生長發育為裂殖子芽孢(merozoites),待肝細胞破裂後,被釋放并進入血液循環。之後 merozoites 入侵紅細胞,在紅細胞内它将經曆環狀體(rings),滋養體(trophozoites)完整的兩個階段,最終發育為裂殖子(schizonts)。Schizonts 中含有 8-32 個 merozoites,其中一部分 merozoites入侵新的紅細胞,進入下一個紅内期;另一部分經過 9-12 天發育為雄性和雌性兩種配子細胞(gametocytes),一旦宿主被按蚊叮咬吸血,就會進入按蚊體内,在按蚊體内生長發育行有性生殖。下面将就瘧原蟲生活周期的具體階段以及入侵肝細胞和紅細胞的機制,進行論述。
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1.2 紅外期的發育
惡性瘧原蟲,紅外期發育大約需要 6 天。攜帶有子孢子的雌性按蚊叮咬人的同時,子孢子伴随着唾液進入人體,經過大約 30 分鐘後随宿主血液循環進入肝髒細胞,之後攝取其營養并進行裂體增殖,發育成 merozoites。成熟後脹破肝細胞,釋放入血液。一旦入侵紅細胞,将開始紅内期的生長發育。目前,對于子孢子入侵肝細胞機制的研究,已取得了很大的進展。子孢子經過 20 分鐘的宿主血液循環進入肝髒,首先需要突破窦狀隙的内皮層,其具體的機制尚未完全闡明,主要存在直接穿過内皮細胞和 Kuppfer 細胞轉運兩種學說。前者基于子孢子強大的運動能力,認為即使内皮屏障孔隙直徑(約 0.1 μM)為子孢子的 1/10,子孢子強大的運動能力也可以使其直接穿過屏障,進入肝細胞[9]。後者經過多年的研究,逐漸豐富的證據表明子孢子進入肝髒的方式為 Kuppfer 細胞的轉運。Kuppfer 細胞是分布于肝窦狀隙具有很強吞噬能力的巨噬細胞。在子孢子入侵肝髒的時候,它首先進入 Kupper 細胞并形成非酸化的納蟲空泡,以此為依托,子孢子對抗了吞噬和溶酶能力使其存活,最終到達了肝細胞[10-12]。
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第 3 章 體外篩選雙氫青蒿素抗藥性惡性瘧原蟲蟲株及表型分析...........61
1 材料與方法............61
2 結果.............65
3 讨論.............73
4 小結.............75
第 4 章 惡性瘧原蟲抗雙氫青蒿素藥物機制的研究.............77
1 材料與方法............77
2 結果.............78
3 讨論.............83
4 小結.............86
 
第 4 章 惡性瘧原蟲抗雙氫青蒿素藥物機制的研究
 
惡性瘧原蟲對臨床一線用藥 ART 類藥物的抗藥性的興起和傳播,嚴重威脅着全球瘧疾的治療和防控。惡性瘧原蟲抗藥性機制一直是重要的研究方向,經過科研人員的不謝努力,取得了一些重要的成績。Benoit Witkowski 研究團隊經過三年的體外 ART 篩選,得到的抗藥性蟲株,轉錄組學研究發現熱休克蛋白和紅細胞表面蛋白的表達的升高;調控細胞周期和 DNA 生物合成蛋白表達的降低[142]。繼續培養 Benoit Witkowski 研究小組的獲得的抗性蟲株,兩年後Fre′de′ric Ariey 研究團隊獲得了抗藥性更強的蟲株,并鑒定基因 kelch 13(PF3D7_1343700)與 ART 敏感性相關,證實基因的突變引起惡性瘧原蟲清除速率減慢[69]。随後的 GWAS 分析了大量的惡性瘧原蟲樣本,進一步驗證了 kelch13 基因在瘧原蟲抗 ART 藥物方面發揮着重要作用[150]。惡性瘧原蟲的抗藥性的機理是複雜的,且存在着遺傳性和非遺傳性的機制。不可能通過已發現的幾個基因位點闡明所有的問題,本研究對惡性瘧原蟲株Dd2 長期不間斷的給予 DHA 的藥物壓力,經過近三年的培養,得到具有較強的抵抗 DHA 特性的抗藥蟲株,通過對其基因組學分析研究,尋找更多 P.falciparum 抗 ART 類藥物的機理,為後續的研究提供新的線索。
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結 論
 
1. 分離馴化得到 67 株臨床惡性瘧原蟲蟲株,常用藥物篩選發現 8 株蟲株存在抗藥性,之後使用 Malaria Box 中 356 種化合物篩選。結果一方面發現抑制效果較好的 54 種化合物,為潛在的新型抗瘧藥物。另一方面發現臨床抗藥性蟲株對 36 種化合物存在敏感性降低,顯示交叉抗藥性。研究結果具有指導新型抗瘧藥物使用的意義。
2. 全基因組測序分析臨床抗藥性蟲株後,發現 11690 個 SNPs 和 113 個CNVs,假序列進化樹顯示了蟲株間的親緣關系。生物信息統計分析得到 21 種基因的 SNPs 與 8 種化合物敏感性相關,11 種基因的 CNVs 與 4 種化合物敏感性相關。新的抗性基因位點的發現,預測了臨床抗藥性的形成機制。
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